单细胞分析技术在干细胞异质性研究中的应用

0 引言 Introduction

干细胞是一种具有自我复制、自我更新能力、多潜能的未分化细胞，它可以作为“种子”细胞，在相关因素作用下分化为特定谱系。干细胞疗法通过替代坏死或变性细胞、分泌各种因子改善损伤环境或通过基因修饰作用促进受损组织或器官功能恢复[1]。

在体外细胞培养中，细胞株或细胞系表现出来的非基因异质性是不可忽略的现象。非基因异质性(non-genetic heterogeneity)是指具有相同基因组的细胞，由于某种非基因水平的调控而呈现不同的表型，是细胞群落的一种固有特性。体外增殖、分化的干细胞往往来源于同一细胞株和细胞系，这些细胞主观上被视为遗传背景完全相同。在用于实验研究时，这些细胞株或细胞系也被实验者默认为是均一的细胞群体，而忽视了细胞集落个体之间的不均一性。单个细胞的转录是个随机事件，异质性反映每个单独的细胞在分子特征、细胞命运和功能结果方面的不同。传统的研究只能反映细胞整体命运，却忽视了单个细胞间表达信息的差异。产生这种异质性的原因可能包括：细胞微环境的异质性、细胞周期的异质性以及细胞基因表达的随机性等[2]。干细胞疗法要求研究者必须精确控制多能干细胞发育为特定细胞和组织类型。干细胞多能状态微小的变化足以影响它将遵循的发育路径。为了揭示调控定向发育因子“决策”回路，就必须要观察每个细胞多能状态的微小波动[3]。近年来随着新型单细胞遗传分析技术的发展，使得监测单细胞发育过程成为可能。干细胞疗法具有很大的应用前景，但其异质性问题是阻碍干细胞进入临床治疗的关键[4]。

单细胞分析是首选对单个靶细胞进行分离与提取，然后对靶细胞内的基因组信息、蛋白信息进行分析，深入了解各个信号通路引起的单细胞变化，探索单个细胞

之间的异质性问题[5]。单细胞技术主要包括两大类：单细胞分离与收集技术、单细胞分析技术。单细胞分析技术通过细胞异质性揭示疾病机制并确定治疗靶点，为将来干细胞用于临床治疗带来福音。该文章对各种技术进行了综述。

1 资料和方法 Data and methods

1.1 文献检索 以“干细胞，单细胞分析”为中文检索词，以“stem cell，single cell analysis”为英文检索词，检索中国知网全文数据库、万方全文数据库、PubMed数据库1990年1月到2019年7月发表的文章。

1.2 文献筛选标准 与干细胞和单细胞检测相关的文献。

1.3 质量评估及数据的提取 计算机初检得到141篇文献，经资料收集者互相评估纳入文献的有效性和适用性，通过阅读文题和摘要进行初步筛选；排除中英文文献重复性研究，以及内容不相关的文献，最后纳入57篇文献进行综述。

2 结果 Results

2.1 单细胞分离与收集技术 通过单细胞分析了解干细胞分化的异质性至关重要，而单个细胞的分离和收集是进行单细胞分析的前提，其技术主要包括传统的手动分离和流式细胞分选，以及近几年发展起来的微流控技术和单细胞机器人技术等。

2.1.1 手动分离和流式细胞分选 手动挑拣和极限稀释是最传统的单细胞分离技术。前者通过最大限度的稀释来获得单细胞悬液，该方法效率低且准确度差；后者通过显微镜观察细胞，利用微滴管吸取得到特定细胞，分离效率极低。流式细胞术是目前常用的单细胞筛选技术，通过光学系统和激光系统对单个细胞的荧光信号和散射信号进行检测，散射信号反映细胞的自身信息，包括形态、大小、内部结构等，而荧光信号反映了特定的细胞表面或内部抗原或抗体的特异信号[6]。

2.1.2 微流控技术 微流控技术根据分离的原理分为2类，一类是不需要借助外力的微孔法和微滴法；另一类为借助外力的声、光、电、磁法。微流控芯片技术具有准确、高通量等特征，但需要借助特殊的设备或器械。

(1)微孔法(流体力学捕获法)：微孔法是在微流控芯片内制备障碍微结构，在细胞悬液中将单个感兴趣的细胞进行分离捕获的方法，包含2种结构，分别为微筛式结构和微坑式结构。微筛式结构通过微挡板阵列拦截和容纳单个目标细胞，在悬液通过后便自动形成了单细胞捕获阵列；微坑式结构是凹槽型结构阵列，当细胞悬液通过芯片时，细胞在重力下进入凹槽中，形成单细胞阵列，由于流体的冲击力小，使被捕获的单个细胞难以被冲走，每个凹槽与单细胞的尺寸相当。WLODKOWIC等[7]开发了含有上百个捕获位点的微流控芯片，应用于肿瘤单细胞的研究，证明了在细胞凋亡评估上这种芯片平台的效果与流式细胞仪相似。DEUTSCH等[8]通过刻蚀的方式在玻璃基底上设计了蜂窝状微坑阵列，将细胞悬液滴在微坑阵列表面，盖上盖玻片静置数分钟，细胞便在重力下沉降落入微坑内，产生了单个细胞的阵列，而每个微坑的大小可以根据不同细胞的种类进行调整。这种捕获阵列的构建有利于接下来的单细胞检测分析，如酶动力学研究、荧光标记等。

文章来源：《造纸科学与技术》 网址: http://www.zzkxyjs.cn/qikandaodu/2021/0128/331.html